CURS
4
Acţiunea
agenţilor fizici, chimici şi biologici asupra
bacteriilor.
Microbiologie ecologică.
Microbiologie ecologică.
Noţiuni generale
Factorii
fizici, chimici şi biologici actionează asupra microorganismelor în
functie de:
-
caracterul speciei,
-
compozitia chimică si faza de dezvoltare (vârsta culturii),
-
structura microorganismului (formă vegetativă, sporulată sau
capsula),
- densitatea suspensiei bacteriene.
Efectul
acţiunii acestor factori este determinat de:
-
concentratia şi timpul de expunere ;
-
concentratia ionilor de H (pH);
-
fenomenul de absorbţie sau adsorbţie.
Efectul
poate fi:
- stimulator,
-
oprirea multiplicării (bacteriostatic),
-
distrugerea bacteriilor (bactericid).
Decontaminarea
microbiană este sterilizarea prin
căldură umedă, prin căldură uscată sau radiaţii.
Sterilizarea
este distrugerea sau îndepărtarea tuturor microbilor inclusiv a
sporilor.
Dezinfectia
este distrugerea formelor vegetative ale microorganismelor, dar nu în
mod necesar şi a sporilor.
În
laboratorul de microbiologie sterilizarea se obtine prin următorii
agenti:
Căldură
uscată
-
încălzire la roşu,
-
flambarea,
-
incinerarea,
-
aer cald;
Căldură umedă
-
peste 1000C
(autoclavare),
-
sub 1000C
(pasteurizare, tindalizarea);
Filtrare.
Radiatii
ultraviolete.
Radiatiile
gamma şi X.
Microunde.
În chirurgie şi stomatologie se mai poate folosi
sterilizarea chlmică prin oxid de etilen, care nu se mai foloseşte
în microbiologie.
Sterilizarea
►
Sterilizarea prin căldură uscată
Încălzirea
la roşu
-
este indicată pentru firul drept , ansa şi spatula de însămanţare.
Flambarea
-
este înfierbântarea obiectului de sterilizat prin trecerea repetată
prin flacără, timp de câteva secunde şi se recomandă pentru:
capilarele pipetelor Pasteur, gura eprubetelor şi a flacoanelor.
Incinerarea
-
este arderea cu reducere la cenuşă.
-
în laboratorul de microbiologie este indicată pentru material din
plastic, reziduuri organice solide, gunoiul, cadavrele şi carcasele
animalelor de experienţă.
Această
metodă pune probleme de control al poluării mediului şi siguranţei
microbiologice.
►
Sterilizarea prin aer cald
Etuva
(poupinelul)
•
Este o incintă cilindrică sau
paralelipipedică cu pereţi dubli din tablă, termoizolanti,
•
Rezistenţa electrică şi un
termostat permit mentinerea constantă a temperaturii selectate,
uniformizată în incinta de sterilizare printr-un sistem de
ventilatie.
•
Obiectele de sterilizat se aşează
pe rafturi din sită metalică.
Procedură:
• Se
aşează obiectele pentru sterilizare pe rafturi, fără a umple
incinta, până la refuz, se lasă mici spaţii între ambalaje,
pentru circulatia nestingherită a aerului cald.
• Se
închide uşa aparatului, se deschid orificiile de ventilaţie şi se
conectează aparatul la reţeaua electrică. Etuvele mari au
ventilator cu palete, care porneşte odată cu rezistenta electrică.
• Se
monitorizează timpul de sterilizare din momentul când temperatura
arată 160°180°C, care este de o oră.
• Se
scot obiectele sterilizate numai după răcirea aparatutui.
Indicatii:
-obiecte
de laborator din sticlă (eprubete), flacoane, pipete, plăci Petri;
-
obiecte din portelan (mojare, pistile),
-
seringi Louer din sticlă,
- instrumentar chirurgical,
- substante grase, pulberi.
Contraindicatii:
-
soluţii apoase,
-
obiecte din cauciuc sau garnituri din cauciuc,
-
seringi din sticlă cu metal,
-
tesături şi vată din bumbac sau fibră sintetică,
- materiale contaminate din laborator.
►
Sterilizarea prin căldură umedă
Sterilizarea
la peste 300°C
Se
utilizează autoclave in care vaporii de apă saturati realizează:
-
115°C corespunde la 0,5 atm
-
121°C corespunde la 1 atm
-
l34°C corespunde la 2 atm
Autoclavul
Este
un cazan cu pereţi rezistenti in care, dup închiderea etanşă cu
un capac masiv , presat cu buloane sau un sistem cabeston, vaporii de
apă se comprimă la presiunea necesară sterilizării.
Autoclavul
cu perete simplu
•
Acestea pot fi verticale sau
orizontale şi sunt indcate pentru sterilizarea solutiilor şi
materialelor contaminate din laborator.
Se
mai sterilizează sticlărie pentru culturi de celulă şi aparatele
de fitrare.
•
Vaporii provin din apa aflată in
cazanul de presiune şi pătrund în camera de sterilizare de jos în
sus prin suportul de tablă perforată pe care se aşează obiectele
de sterilizat.
Un
monometru controlează presiunea din interiorul cazanului.
• Un
robinet de vapori, aflat în partea superioară a autoclavului, pune
in legătură cazanul cu exteriorul.
• A1
doilea robinet, aflat la partea inferioară, permite evacuarea apei
din cazan.
• O
supapă de siguranţă evacuează vaporii când presiunea lor
depăşeşte limita de securitate.
•
Cazanul este cuprins într-un manşon
de tablă groasă, care la partea inferioară formează un loco
pentru adaptarea sursei de căldură, sau poate fi conectat la o
sursă de curent
Procedura
l.
Se toarnă apă în cazan prin incinta de sterilizare, până la 2-3
cm sub nivelul suportului.
2.
Se aşează pe suport obiectele de sterilizat, în ambalajul lor.
Ambalajele
sunt: flacoane, eprubete, coşuri pentru eprubete, flacoane mici,
cutii, casolete, hârtie pentru împachetarea unor obiecte, găleti
sau saci termorezistenţi, pentru materialul de laborator contaminat.
Se
introduc flacoanele cu capacul semiînşurubat cutiile întredeschise,
casoletele cu orificiile deschise, găleţile fără capac.
3.
Se închide etanş capacul strângând buloanele diametral opus in
cruce, întâi cu mâna, apoi complet cu pârghie.
4.
Se conectează la sursa de căldură.
5.
Se deschide robinetul pentru evacuarea aerului.
6.
O dată cu vaporii de apă, prin robinetul deschis, se evacuează şi
aerul din incinta de sterilizare, asigurând o convectie puternică:
vaporii in contact cu obiectele reci cedează căldura şi se
condensează presiunea lor tinde să scadă şi atrage
altă cantitate de vapori care transporta şi cedează căldura
ş.a.m.d.
Aerul
este complet evacuat din incinta de sterilizare, când încetează să
mai barboteze apa.
7.
Închide robinetul de evacuare a aerului.
8.
Când presiunea ajunge la valoarea aleasă se reglează sursa de
căldură pentru a menţine presiunea pe toatâ durata sterilizării.
9.
Se întrerupe sursa de căldură şi lasă aparatul să se răcească
până când manometrul indică zero atmosfere. Numai
în acest moment deschide lent robinetul de vapori, apoi cazanul.
10.
Nu se deschide autoclavul cât timp presiunea este peste cea
atmosferică pentru că lichidele fierbinti vor fierbe exploziv şi
se pot sparge fÎacoanele.
11.
Lasă materialele pentru uscare în autoclavul deschis, când
materialele ajung sub 80°C pot fi scoase. Aceasta durează în
functie de volumul ambalajelor şi vâscozitatea solutiilor.
Flacoanele mari cu mediu agarizat pot necesita şi câteva ore.
Dezavantaje
În
ambalaje pot persista pungi de aer, cantitatea mare de condens în
timpul sterilizării, uscarea dificilă după sterilizare impune o
serie de precauţii (evitarea contactului cu obiecte ambalate în
hârtie cu suprafeţe nesterile, până la perfecta uscare a
ambalajului).
►
Pasteurizarea
Este o metodă de sterilizare parţială, prin care se
distrug numai formele vegetative, deoarece utilizează temperaturi
puţin ridicate şi de scurtă durată:
-
650C
pentru 30 min,
-
80-900C
pentru 1-2 min,
-
91-950C
pentru câteva secunde.
Scăderea
temperaturii se face brusc. Acest procedeu se foloseşte la
sterilizarea laptelui, unde distruge formele vegetative fară a
provoca alterarea vitaminelor, a enzimelor, a proteinelor.
►
Tindalizarea (sterilizarea
fracţionată)
Este
încălzirea la temperaturi de sub 100°C.
Principiu:
in medii ce permit germinarea sporilor, încălziri repetate omoară
atât formele, vegetative existente iniţial cât şi pe cele
germinate din spori în intervalele dintre încălziri.
Indicaţii:
sterilizarea unor medii de cultură, alimente.
Necesar:
-
autoclav pentru tindalizare la sub 100°C, în vapori fluenţi
(autoclav
cu robinetul pentru vapori deschis);
-
boia de apă sau nisip pentru tindalizări sub 1000C.
Procedură:
Substantele
de sterilizat in volume mai mici de 1 litru, se menţin 30-60 min la
80-90°C, 3-8 zile consecutiv, la temperatura impusă de compozitia
lor.
În
intervalele dintre încălziri, recipientele se ţin la temperatura
camerei pentru germinarea sporilor.
►
Filtrarea
•
Este trecerea unui fluid printr-un
corp poros.
Filtrele
cu porozităti convenabile pot debarasa de microorganisme fluidul
filtrat, acestea fiind retinute mecanic şi electrostatic in porii
filtrului.
• Se
recomandă pentru sterilizarea: aerului, a unor medii de cultură sau
reactivi care nu suportă încălzire.
Filtrele
clasice sub forma unor
-
lumînări goale pe dinăuntru şi închise la capăt (bujii
filtrante), confecţionate din porţelan (filtre Chamberland), sau
-
pământ de infuzorii (filtre Berkefeld), sau
-
plăcile filtrante din azbest impregnat cu caolin (filtre Seitz) sau
-
sticlă poroasă (filtre Schott), sunt astăzi înlocuite prin
-
membrane filtrante din acetat de celuloză cu porozităti între 1 şi
0,025 µm.
• O
membrană cu porozitatea de 0.22 pm retine tonte bacteriile.
•
Aceste membrane sunt fixate pe un
suport perforat din otel inoxidabil şi montate in partea superioară
şi inferioară a unei pâlnii adaptate la sistemul de filtrare
negativă şi pozitivă.
•
Membrana împreună cu pâlnia
montate la recipientul de colectare a fluidului filtrat sunt
sterilizate în prealabil ln autoclav.
•
Filtrele HEPA (High Efficiency
Particulate Air Filtres) sunt folosite pentru sterilizarea aerului
din boxele de siguranţă antiepidemică, a celor cu aer laminar etc.
► Sterilizarea
prin radiatii ultraviolete (UV)
• Se
mai numesc şi lămpi germicide sunt tuburi din sticlă specială în
care descărcările electrice într-o atmosferă cu vapori de mercur,
la joasă presiune, generează radiatii UV.
•
Cantitate de ozon produsă de lămpile germicide din
spitale şi laboratoare nu depăşeşte
concentratia periculoasă de o parte la 10 milioane şi
scade progresiv cu vârsta lampii.
• Viata de funcţionare a lămpilor,germicide uzuale,
este de 100 ore, dar scade dupa aprinderi frecvente.
• Când intensitatea radiatiei UV produse scade sub
60% din cea nominală, după şi din timpul prevăzut, lămpile
trebuie schimbate.
Lămpi
germicide
•
Lămpile speciale cu catod rece au o
viaţă mai lunga.
•
Pentru a mentine efectul germicid
maximal, lămpile trebuie periodic curăţate prin ştergere cu o
cârpă moale umezită în alcool, amoniac şi apă.
Aceste
lămpi se recomandă pentru:
-
reducerea încărcăturii microbiene a spaţiilor de lucru,
-
bariere protectoare între aria cu animale inoculate, boxele de
necropsie şi persoanele din laborator sau animalele sănătoase,
-
laboratoarele care nu au hote le pot folosi pentru repartizarea
mediilor de cultură, manipulării aseptice,
-
suprafeţe din laborator, nu în timpul lucrului.
►
Radiaţiile gamma şi X
•
Sunt radiatii ionizante foarte
eficiente pentru sterilizare, utilizarea lor: trebuie să fie
folosite cu prudentă pentru că pot distruge şi celulele umane.
•
Aceste radiatii generează radicali
liberi, care reactionează chimic cu proteinele şi acizii nucleici
provocând moartea bacteriei.
►
Microunde
• Se
utilizează pentru resterilizarea mediilor de cultură care au fost
depozitate timp îndelungat, sterilizarea rezultă din căldura
produsă de microunde, decât ca un efect direct al lor.
►
Ultrasunete
•
Sunt bactericide prin fanomenul de
cavitatie pe care îl produc la trecerea prin apa extra şi
intracelulară, determmond dezagregarea structurii bacteriene.
Controlul eficientei steritizării
Se
face prin indicatori:
- fizici (manometre, termometre),
-
chimici şi
- biologici.
Indicatori
chimici pentru sterilizarea prin căldură
• Se
folosesc substante chimice al căror punct de fuziune este cunoscut
la care aspectul substantei se schimbă exemplu:
-
floare de sulf 115°C,
-
tiouree 180°C,
-
acid benzoic 121-122°C.
Indicatori
biologici
•
Fire de bumbac impregnate cu spori de Bacillus
stearotermophilus (pentru etuve) sau fiole cu suspensie B.
stearotermophilus (pentru autoclave), au o mai mare fidelitate.
•
După sterilizare se testează viabilitatea sporilor
prin însămânţarea lor în medii adecvate.
Testul
Bowie & Dick
Teste
Bowie & Dick - indica puterea de penetrare a aburului in timpul
procesului de sterilizare.
Conform
legislaţiei in vigoare acest test este obligatoriu pentru autoclave,
inainte de efecturarea primei sterilizări.
Utilizare:
-
zilnic dacă se sterilizeaza doar textile;
-
cel putin o data pe săptamână dacă se sterilizeaz şi
instrumentar;
- dupa fiecare reparatie a sterilizatorului.
•
Indicatorul din mijlocul pachetului
trebuie sa vireze uniform si pe toata suprafaţa schimbandu-si
culoarea.
Se
realizează un ciclu de sterilizare complet ( cu pre şi
postvacuumare) la temperatura de 134°C, timp de 3,5 min.
•
Dacă penetrarea aburului nu a fost
uniformă, au existat pungi de aer, culoarea benzilor este neuniformă
(apar pete mai clare), în această situaţie, sterilizarea nu a fost
eficientă, autoclavul nu trebuie utilizat şi se apelează la
tehnician pentru verificare.
• La
sfârşitul ciclului complet de sterilizare se extrage din pachet
testul şi se interpretează rezultatul. Dacă ciclul a fost eficient
(absenta aerului rezidual sau a pungilor de aer), schimbarea culorii
modelului geometric imprimat este uniformă.
DEZINFECŢIA
•
Este procedeul prin care se distrug microorganismele
patogene, fără a fi necesară distrugerea germenilor saprofiţi.
În
laboratorul de microbiologie sunt folosite substante chimice pentru
dezinfectia: mâinilor, duşumelelor, meselor, cuştilor de animale
şi a unor produse patologice (sputa, fecale).
Aceste
substanţe se numesc:
-
dezinfectante,
dacă din cauza efectelor iritante sau toxice se pot aplica numai pe
suprafeţe inerte şi
-
antiseptice,
dacă toxicitatea este mai redusă, permite aplicarea lor pe
tegumente, unele mucoase sau plăgi.
Uneori
aceeaşi şubstanţă (cloramina B) în solutii diluate este
antiseptic, iar în soluţii concentrate este dezinfectant.
•
Cele mai sensibile la substanţele
dezinfectante sunt:
-
organismele sub formă vegetativă (bacterii, fungi, protozoare);
-
virusurile cu înveliş lipidic;
Relativ
rezistente sunt: micobacteriile,
virusurile nude.
Rezistente
sunt: endosporii bacterieni, sporii fugici.
Un
dezinfectant trebuie să îndeplinenscă următoarele conditii:
-
să actioneze asupra unui număr cât mai mare de agenţi patogeni;
-
să producă inactivitatea ireversibilă a germenilor într-un timp
cât mai scurt şi să acţioneze cât mai independent de condiţiile
de mediu;
-
să fie cât mai stabil, să-şi păstreze calităţile cât mai mult
timp în condiţii obişnuite;
-
să fie uşor de manipulat, ieftin, să nu fie inflamabil sau
explozibil.
În laboratorul de microbiologie se folosesc:
Formolul
(soluţie de aldehidă formică 40 % în
apă),
-
este toxic asupra bacteriilor (forme vegetative şi spori), a
virusurilor;
-
se foloseşte sub formă de: vapori (dezinfectia camerelor), lichidă
(prin stropire, pulverizare cu vermorelul) sau prin imbibare (o parte
formol comercia140% şi H2O).
Mertiolatul
de sodiu
-
În soluţie de 1/2000 pentru dezinfectia: mâinilor,
instrumentarului contaminat, obiectelor din piele, cauciuc.
Alcoolul
etilic (spirtul)
-
alcoolul de 700,
-
alcoolul dublu rafinat (960
alcoolice) are o acţiune dezinfectantă slabă, coagulează rapid
albuminele din mediu care formează astfel un strat protector pentru
bacterii.
Alcoolul
de 70° acţionenză mai lent, mai profund şi se foloseşte pentru
dezinfecţia: mâinilor, instrumentelor. El poate fi obtinut din 100
ml alcool de 96o
şi 400 ml AD.
Glicerina
Este
un lichid vâscos care se amestecă bine cu apa, se foloseşte pentru
distrugerea bacteriilor, dar poate conserva unele virusuri.
Fenolul
În
stare pură sunt cristale incolore care devin roşietice în contact
cu aerul, din cauza oxidării.
Se
păstrează în vase brune în concentratie de 3-5 %, omoară
microbii în 36-60 min.
Puterea
dezinfectantă a unor substante chimice se exprimă în comparatie cu
cea a fenolului, stabilinduse „indicele fenolic".
Crezolii
(metilfenolii) sub formă lichidă, au
efect toxic asupra protoplasmei;
Creolina
-
Este amestec de crezoli activati cu săpun de gudron, este un lichid
brun închis solutie 5-10 % cu AD, are efect bactericid crescut, dar
cu miros neplăcut.
Amestecul sulfocromic
Trebuie
să fie nelipsit de pe masa de laborator, pentru sterilizarea
pipetelor, lamelor contaminate.
După
utilizare amestecul se oxidează, din roşu-portocaliu, devine verde,
în acest caz trebuie schimbat.
Sublimatul
(bicromura de mercur)
Este
o sare slabă, cristalină, incoloră are putere bactericidă în
solutie de 1% este bactericid în 1-10 min, iar în sol. 1/500,
omoară formele sporulate în 45-60 min, nu alterează tegumentele şi
mobilierul, nu este toxic pentru om şi animale.
Varul cloros
Este
o pulbere grunjoasă albă, cu miros puternic de clor.
Cand
este proaspăt conţine 25% clor.
Se
adaugă 200-400g var în fiecare kg de spută sau fecale. Se poate
obtine laptele de var sol. 10%, se foloseşte pentru dezinfecţia
sputei, cuşti de animale, etc.
Cloramina
Este
o pulbere fină, cristalină, albă, uşor gălbuie cu miros de clor
activ.
În
concentratie de 0,1-5%, distruge sporii, iar 5-10 % pentru
distrugerea bacilului Koch.
Permanganatul
de potasiu (KMnO4)
Sunt
cristale mari violet închis, se folosesc pentru dezinfecţia:
mâinilor sol. 1%, mucoasei bucale sol. 1/5000, mucoasei oculare
1/10.000
Apa
oxigenată (H2O2)
sau peroxidul de hidrogen,
Are
putere bactericidă prin eliberarea de O2,
se utilizează în concentratia de 3%.
Bazele tari
Hidroxidul de sodiu 2-4%, omoară bacteriile, virusurile
Varul
(oxidul de calciu) se stinge cu apă
(600 ml apă la 1 kg de var) este hidroxidul de calciu, din el se
obtine laptele de var sol. 10%, iar sol. 20% se foloseşte pentru
dezinfectia fecalelor, urinii.
Săpunurile
sunt săruri de sodiu ale unor acizi graSi, ele acţionează prin
emulsionarea grăsimilor şi îndepărtarea mecanică a murdăriei.
Detergentii
Au
actiune bactericidă şi de emulsionare, se folosesc pentru
materialele de laborator, înlocuind săpunul.
Detergeniii
anionici,
Dau
prin disociere, anioni organici toxici, activi mai ales pe bacterii
Gram pozitive, pentru spălarea: instrumentarului, a aparaturii,
pardoselelor, mobilierului, tesăturilor.
Detergentii
cationici
Au
acţiune antiseptică mai puternică decât a celor anionici, ex.
Bromocetul, dezinfectant in sol. 1% şi antiseptic în sol. 1‰
. Deoarece în prezenta săpunurilor îşi pierde din activitatea
antimicrobiană, este necesar ca pentru aseptizarea mâinilor să fie
indepărtat săpunul cu apă şi apoi cu alcool.
Detergentii
amfolitici
Se
folosesc in sol. apoasă 1% , pentru dezinfecţia instrumentarului de
laborator, a mobilierului.
